Funktionelle Analyse molekularer Mechanismen der strahleninduzierten Apoptose, die nicht über direkte DNA-Schäden vermittelt werden : Vorhaben 3607S04531

Abstract

Die Wirkungen geringer Strahlenexpositionen stellen neue Anforderungen an den Strahlenschutz. Untersuchungen haben gezeigt, dass die individuelle Empfindlichkeit gegenüber der tumorigenen Wirkung ionisierender Strahlung beträchtlich variiert. Individuelle Variabilität in der Strahlensensibilität ist meist genetisch bedingt. So zeigen Patienten mit den chromosomalen Instabilitätssyndromen Ataxia telangiectasia (A-T), Nijmegen Breakage Syndrom (NBS) und Bloom Syndrom (BS) eine starke Überempfindlichkeit gegenüber ionisierenden Strahlen sowie ausgeprägte Immundefekte, und sie entwickeln überdurchschnittlich oft Leukämien und Lymphome. Dieser Zusammenhang zwischen Strahlenüberempfindlichkeit und erhöhter Tumorinzidenz, sowie das gehäufte Auftreten von erhöhter Strahlenempfindlichkeit bei der Behandlung genetisch nicht charakterisierter Tumorpatienten legt nahe, dass innerhalb der Bevölkerungsgruppe von Tumorpatienten genetische Disposition für Strahlenüberempfindlichkeit überrepräsentiert sein kann. Erhöhte zelluläre Strahlenempfindlichkeit zeigt sich v.a. in der Störung zellulärer Reaktionen auf die ausgelösten Schäden, wie Zellzyklusarrest, DNA-Reparatur und Apoptose. Apoptose dient als wichtiger genetisch determinierter Parameter für die individuelle Strahlensensitivität. Erhöhte Empfindlichkeit kann durch vermehrte Apoptose verursacht werden, Tumorresistenzen können durch erniedrigte Apoptose bedingt sein. Verbesserte Kenntnisse im Bereich der unterschiedlichen molekularen Mechanismen strahleninduzierter Apoptose sind damit sowohl für den Strahlenschutz als auch für eine optimale Strahlentherapie von großer Bedeutung. Im vorliegenden Projekt wurde die Einleitung strahleninduzierter Apoptose mechanistisch untersucht. Da ionisierende Strahlung sowohl direkt DNA-Schäden induziert als auch reaktive Sauerstoffspezies generiert, lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Unterscheidung und Gewichtung von DNA-Schadens-vermittelter Apoptose und Apoptose, die durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) verursacht wird. Zur Bearbeitung dieser Fragestellung wurden etablierte Zellkulturmodelle und aus Patientenmaterial gewonnene EBV-immortalisierte lymphoblastoide Zelllinien verwendet. Die Patienten-Zelllinien wurden im Rahmen einer Kooperation vom Institut für Epidemiologie (HMGU) und einem früheren BfSgefördertenProjekt (StSch4362) zur Verfügung gestellt. Sie stammen aus der LUCY (Lung Cancer in the Young)-Studie sowie aus dem Proben-Kollektiv der Kooperativen Gesundheitsforschung in der Region Augsburg (KORA). In diesen Zelllinien wurde die strahlen-induzierte Apoptose, die durch direkte Strahlenwirkung an der DNA und durch Wirkung von strahleninduzierten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verursacht wird mit der Etoposid-induzierten ROS-unabhängigen Apoptose verglichen. Das Ausmaß der Apoptoseinduktion wurde mit der Apoptose des primären Ausgangsmaterials verglichen und die Aktivierung von apoptose-relevanten Faktoren wurde mittels Protein-Expressionsarrays untersucht. Die ausgewählten Linien zeigten deutliche Unterschiede in ihrer Apoptoseinduktion und wurden in hoch, mittel und niedrig apoptotisch eingeteilt. Der Vergleich zwischen primären und immortalisierten Zellen zeigte, dass sich die beiden Zellsysteme deutlich voneinander unterscheiden und die EBV transformierten Zelllinien nur bedingt als Ersatz für primäre Zellen in mechanistischen Untersuchungen zur strahleninduzierten Apoptose geeignet sind. Die Analyse der Expression von Apoptose-relevanten Faktoren zeigte Veränderungen von Komponenten aus Schadens-vermittelten und aus ROS-induzierten Prozessen. Ein Vergleich der Proteinexpression zwischen hoch- und niedrig-apoptotischen Linien ergab eine veränderte Expression für die Proteine Bcl-2, FADD und XIAP. Als etablierte Zellkulturmodelle zur Untersuchung von Apoptosemechanismen wurden Epithelzellen (Hela), Keratinozyten (Scl II) und die T-Zelllinie Jurkat eingesetzt. In diesen Zellsystemen wurden apoptose-relevante Faktoren mittels RNA-Interferenz herunterreguliert. Anschließend wurde der Einfluss der modulierten Proteine auf die Apoptose bestimmt. Überraschenderweise ergab ein Vergleich von strahleninduzierter Apoptose und etoposidinduzierter Apoptose eine in etwa gleiche Identifikation von Faktoren die das Apoptoseverhalten beeinflussen. Ein Vergleich zwischen den Linien ergab, das nur Caspase-8 in allen drei Systemen einen einheitlichen Einfluss auf das Apoptoseverhalten hat. Dieses Ergebnis unterstreicht die zelltyp-spezifität von Apoptoseprozessen, gleichzeitig wird dadurch aber auch die Bedeutung von rezeptor-vermittelten Prozessen in der strahleninduzierten Apoptose hervorgehoben. Im Rahmen der Analysen an HeLa Zellen wurde auch die strahleninduzierte Lipidperoxidation untersucht. Durch den Nachweis von Malondialdehyd gelang der transiente Nachweis von strahleninduzierten Lipidperoxiden in Zellysaten und Zellkulturüberständen. Es konnte jedoch keine Korrelation zwischen Grad der Apoptoseinduktion und Lipidperoxidkonzentration gefunden werden.